【Thorlabs教程】激光扫描显微镜

介绍

激光扫描显微镜(以下简称LSM)，特别是共聚焦LSM和多光子LSM，能够对厚块样品进行逐层成像。在共聚焦LSM中，焦平面之外的样品产生的光信号会被光阑阻挡而无法探测；多光子LSM在焦平面以外不会产生任何可探测信号。如下图所示，绿色表示产生的信号。

对比机制

生物样品的对比度比较低，在LSM中一般使用荧光来提高对比度。荧光分子首先吸收一定能量的光从基态跃迁到激发态，然后在返回基态时发出荧光。荧光强度与入射激光强度成正比。由于自然损耗，荧光光子能量低于入射光子，即波长更长。如下图A所示。

多光子激发在两个或更多光子同时到达并且能量总和满足跃迁能量时才会发生。荧光光子能量将高于入射光子，即波长更短。如下图B所示。

多光子还有使用非吸收过程的对比度机制，如谐波和合频。在允许谐波产生的条件下，多个入射光子将同时湮灭并产生一个新的光子，其能量是之前所有光子的能量总和，如下图C所示。

LSM产生信号原理，其中A和B为吸收过程，C为非吸收过程

多光子显微镜的非线性特性意味着要求高光子密度才能观察谐波产生。为了满足这个条件，且保持较低的平均功率，一般使用锁模飞秒激光器，特别是钛蓝宝石激光器。

图像形成

在点扫描LSM中，点光源在样品上成一个衍射极限光斑，然后又成像到单点探测器上，一般使用光电倍增管，但某些情况也可以是雪崩光电二极管。单点扫描和单点探测技术的一个明显优势在于，可以根据特定的实验要求设置显示图像分辨率、光学分辨率和扫描场。

在共聚焦LSM中，平行光通过扫描系统和物镜后在样品上形成一个衍射极限光斑。被激发的荧光信号在二向色镜与激发光分离并聚焦。针孔就位于该焦点位置，焦平面之外的荧光信号会被针孔阻挡，从而形成光学切面。

多光子LSM在焦平面之外几乎不会产生荧光信号，不需像共聚焦LSM一样使用针孔选择荧光，因此光路更简单，探测器可以尽可能靠近物镜，最大化信号收集效率。